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什么是荧光定量PCR、数字PCR ?

2022-11-23 金梦
一、技术篇


在全球医疗器械行业中,体表诊断是占比最高的细分领域之一,凭据诊断道理的分歧,体表诊断产品分为分子诊断、免疫诊断、生化诊断等多种类型。其中,分子诊断的活络度、特异性、正确性等均较为凸起,尤其是在新冠肺炎疫情全球舒展的大布景下,以PCR为代表的分子诊断技术得到了加快发展。

PCR,即聚合酶链式反映(Polymerase Chain Reaction)的英文缩写,是一种以DNA双链复造道理为基础,对特定核酸样本进行体表扩增的生物技术,可能将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍,便于后续的分析钻研。该技术源起于20世纪70、80年代,经过几十年的发展,经历了初代传统PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变,在医疗筛查诊断、性命科学基础钻延注法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面得到宽泛利用。


1.荧光定量PCR          

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,简称qPCR,是在PCR反映系统中参与荧光物质(荧光染料或荧光象征的特异性探针),利用荧光信号堆集实时监测整个PCR过程,后通过尺度曲线对未知模板进行定量分析的步骤。

荧光定量PCR

与通常PCR相比,实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃。使用该项技术,能够对DNA、RNA样品进行相对定量、定量和定性分析。

荧光定量PCR尝试过程

(图:荧光定量PCR尝试过程)



2.数字PCR         

数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可让你可能直接数出DNA分子的个数,是对肇始样品的绝对定量。PCR现实上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反映,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

数字PCR技术道理

(图:数字PCR技术道理)


凭据微反映单元的分歧大局,数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前,市场上重要的数字PCR产品重要是基于微滴式和芯片式。


三代核酸检测技术对比:

技术步骤

概想

技术优势

技术劣势

传统PCR

选取通常PCR扩增仪扩增靶基因,通过琼脂糖凝胶电泳对产品进行定性分析

1.可实现特定核酸片段的体表复造

1.有关核酸染料对操作人员和环境拥有风险

2.易出现假阳性了局

3.耗不断间长、操作复杂

4.无法正确定量

荧光定量PCR

是一种在DNA扩增反映中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反映(PCR)循环后产品总量的步骤。通过内参或者表参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

1.传染风险低

2.操作流程更单一、经济高效

3.样品加样量少

1.分歧厂家出产的试剂和设备之间的差距对检测了局影响较大,不具备可比性

2.存在布景值的影响,了局易产生误差

3.低拷贝的DNA难以检测

4.受PCR抑造物的影响较大

数字PCR

将核酸样品分配到大量独立、平行的微反映单元(纳升级)中,部门反映单元蕴含靶标分子(阳性),而其他不蕴含(阴性),接着进行扩增,并利用TaqMan化学试剂或染料象征探针检测靶标序列,可能实现靶标分子的绝对计数。

1.特异性强、活络度高

2.绝对定量,正确性好

3.抗滋扰能力强

1.特异性强、活络度高

2.绝对定量,正确性好

3.抗滋扰能力强




一、光学原理解决规划篇



1.荧光定量PCR       

荧光定量PCR二向色镜荧光定量PCR


荧光定量PCR光路图荧光定量PCR光路图
(图:荧光定量PCR光路图)


荧光定量PCR光谱
(图:荧光定量PCR光谱)


解决规划一:

荧光通路引发波长发射波长二向色镜
技术参数
Atto425Ex 430/10Em 480/10\设计波段 300-1100nm@OD6
FAMEx 470/10Em 515/10\中心波长误差±2nm
HEXEx 535/10Em 565/10\半带宽10±2nm
ROXEx 585/10Em 614/10\实现方式单片 / 胶合
CY5Ex 630/10Em 670/10\镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
CY5.5Ex 682/10Em 725/10\峰值透过率>85%

  

解决规划二:

荧光通路引发波长发射波长二向色镜
技术参数
FAMEx 470/30Em 520/20505二向色镜设计波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 530/20Em 565/20550二向色镜中心波长误差±3nm
ROXEx 570/20Em 615/20590二向色镜半带宽30±3nm、20±2nm
CY5Ex 630/20Em 675/20647二向色镜实现方式单片 / 胶合

镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
峰值透过率>90%


2.数字PCR        


数字PCR滤光片

数字PCR


数字PCR光路图

数字PCR光谱

(图:数字PCR光路图)(图:数字PCR光谱)


解决规划:

荧光通路引发波长发射波长二向色镜
技术参数
FAMEx 488/20Em 527/20505二向色镜设计波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 527/20Em 567/15550二向色镜中心波长误差±2nm
ROXEx 572/28Em 615/24590二向色镜半带宽20±2nm
CY5Ex 625/26Em 661/11647二向色镜实现方式单片 / 胶合

镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
峰值透过率>90%


标签: PCR 荧光定量
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